01 Dec 2016
Il biologo dr. Doping racconta su fissaggio di componenti di celle di modo di vivere, molecole e l'arte di congelare il nucleosome fibril.
Viviamo in un tempo postgenomico. Tutti possono andare, sequenced il suo genoma e ottenere informazioni piene sui geni che sono trovati nella sua cella. Una cella ha contenuto 46 cromosomi umani, e la lunghezza totale delle molecole di DNA (ogni cromosoma contiene una molecola di DNA) di circa due metri. In effetti, è una molecola molto lunga, sottile. Due metri di DNA in ogni nucleo di cella impacchettato in minuscolo. Le dimensioni del nucleo di circa 10 micrometri. Si ritiene che il compaction di DNA in una cella - è circa 10 000 volte, che è abbastanza una strada fantastica la molecola compactisized. Il paradosso è quello che se legge il genoma non è particolarmente difficile, ancora non capiamo come questo gene compactisized nella cella. Questo problema, che è stato studiato durante più di un secolo di sicuro, è molto lontano da esser risolto. Periodicamente le storie avvengono quando deve radicalmente cambiare la nostra comprensione di come il processo di DNA compaction nella composizione del nucleo di cella o in cromosomi mitotic.
Il principio fondamentale del compaction di molecole di DNA, con ogni probabilità associate con la formazione di fibrils sempre più grosso coerente. La molecola compactisized prima in fibrils eccellente, e poi questo fibril sottile compactisized più grosso, che ancora più grosso, e in alcun punto gira il cromosoma mitotic. Fino a recentemente, è sembrato che questi livelli sono descritti più o meno. Il primo livello di compaction della molecola di DNA è collegato alla sua interazione con proteine histone cosiddette. Ci sono due gruppi principali di proteine histone. Il nucleo histones - questo histones H2A, H2B, H3 e H4, due molecole di ciascuno di questi histones formano una struttura di proteina che è data forma come un disco da hockey. E il disco da hockey ferisce la molecola di DNA. La molecola di DNA, il sottile e sottile, il 2-nanometers fanno 1,7 giro d'affari intorno a questa lavatrice va nel sito linker è allora la prossima lavatrice e così via. Questa struttura può esser vista in un microscopio di elettroni, è stato chiamato «perline su uno spago» e uno spessore di circa 10 nanometers fibrils. Se lo ritennero durante molto molto tempo, il primo livello di compaction della molecola di DNA.
La vitamina B12 l'iniezione di Cyanocobalamin - è essenziale per sintesi di DNA.
In modo interessante, all'inizio dello studio, quando ci fu microscopia di elettroni (e senza esso è impossibile studiare il DNA compaction), si presunse che questo è l'essenziale, l'essenziale e unico fibril, da quale allora in qualche modo il cromosoma formato. È stato collegato al metodo di studio. Il microscopio di elettroni non è possibile guardare celle di modo di vivere. Gli elettroni non possono volare attraverso oggetti grossi, perché l'oggetto deve essere molto sottile. Perciò, può guardare specimen solo morti. Come fare un campione dei morti, dipende dallo stato della tecnica sperimentale. Naturalmente, è necessario che tutti gli ingredienti fossero in posto e la struttura del più ritenuto le caratteristiche particolari per esso in una cella di modo di vivere. Con questo scopo, una varietà di liquidi che sono versati sulla gabbia, uccidono la cella e, perfettamente, tutti i componenti sono fissati lo stato dov'è stato nella cella di modo di vivere - questa procedura di fissazione.
Uno dei primi buoni morsetti che sono stati usati in microscopia di elettroni, è stato l'osmio tetroxide. È bene catture lipids e lega molto male acidi nucleici, le proteine, quindi è visto nelle celle fibril 10-nanometer. Allora è venuto i morsetti di aldeide più di successo, che sono capaci di interagire con proteine già. Veramente hanno suturato tutto lo spazio di cella interno in una tale rete, collegando le proteine, che sono vicino all'un l'altro. E queste serrature più che di successo. E quando le sequenze furono l'aldeide usata, si scoprì che nessun fibrils 10-nanometer non può esser trovato nel nucleo di cromosomi e trovò fibrils più grosso, che chiamò fibrils elementare chromatin. Il suo spessore è circa 25-30 nanometers. E durante decenni si ritenne che questo è il fibril è il componente fondamentale di DNA compaction.
Usando aldeidi o qualcos'altro per fissare, è la fissazione chimica, la cella - tutti capiscono che - può essere una varietà di cambiamenti, e la quantità di informazioni scorrette è sufficientemente grande. Così avviene quello che al momento di fissazione di alcune proteine cambia la loro posizione o perfino estratto, lasciando le celle. Adesso c'è una tecnica di osservazioni intravitali e può essere rispetto a questo nella cella di modo di vivere, e che dopo fissazione. La fissazione conduce a manufatti numerosi. Perciò, sempre voglio trovare un modo di esplorare più nativamente chromatin la struttura, compreso in microscopia di elettroni. Ma la microscopia di elettroni per essere?
Vedi che la cella intera non può essere esattamente vivo. La gabbia deve esser tagliata molto, le fette molto sottili - 30, 50, 70, 100 nanometers, ma più grosso, o gli elettroni non sono scioperi. Comunque, la tecnologia che ha permesso più o meno nativamente visto in un microscopio di elettroni a una cella è stata sviluppata. E è già collegato senza fissativi chimici e fissazione fisica, vale a dire congelandosi. In teoria, la cella - è una bolla dell'acqua, in cui le molecole diverse galleggiano, e se lo congela, sarà probabilmente bene. Il problema è ben noto: durante il congelamento, i cristalli di ghiaccio sono formati, che sono distrutti (biomolecules in generale sono molto teneri) nell'estremo. Ma non possiamo soltanto congelare e trasferire l'acqua in stato di vitrified. Congelandosi a molto grande velocità, i cristalli di ghiaccio non hanno il tempo per formarsi, l'acqua liquida è veramente soltanto stabilizzata. Le molecole l'arresto diffuso con grande velocità, la struttura intera è stabilizzata, e è veramente difficile, ma l'acqua là non è nessun cristallo. Il problema è stato questo per muovere l'acqua in un tale stato.
Il modo più facile di tradurre in un tale stato - per prendere molto, le goccioline molto piccole e rapidamente raffreddarli. E se questo è fatto, è questo mantiene la sua struttura nativa nella gocciolina. Se guarda un campione di uno stato di vitrified, si spera che vedremo come veramente guardare organelles certo, struttura della molecola di DNA compactisized - qualcosa. Lo faccia abbastanza difficile, la tecnologia ha evolto molto molto tempo. La strada più facile, che è usata adesso molto attivamente per esplorare le molecole di proteina diverse, i complessi, i virus, ribosomes, per il fatto che la soluzione campione, che contiene i complessi macromolecolari, con velocità incredibile è abbassata nell'abbronzatura liquida. La temperatura è bassa, e molto rapidamente è congelata.
Ma nel caso di celle, almeno con celle di animale, questo metodo lavora è molto più cattivo. Tuttavia, sono grandi per un tal approccio. Ma la tecnologia si è sviluppata, e i metodi sono stati proposti, che ha permesso di congelare grandi celle, le celle per esempio umane. Un approccio è come segue: il campione è raffreddato nello stesso momento molto velocemente ed entra nella zona di alta pressione. L'alta pressione durante congelamento (com'è conosciuto, congelando l'acqua si allarga poco, e la densità di ghiaccio meno che la densità d'acqua) non aumenta il volume, e come risultato, l'acqua non cristallizza e è staccata in uno stato di vitrified. In parole, è molto semplice, ma in effetti e lo strumento complesso, e lavorare in esso forte e ottenere buoni risultati su esso - è un'arte ancora artistica.
Se questo è così congelato, il campione diventa lo stato di vitrified, cioè c'è stata una serratura fisica. I grandi campioni sono congelati come pezzettini possibili, ma microscopici di tessuto, perfino tessuto, senza contare le celle individuali possibili. Allora il ghiaccio può essere, perché questo congelato, con precisione tagliato con precisione. Naturalmente, sono anche dispositivi speciali, che sono capaci di produrre la talea congelata. Le sezioni più lontano congelate possono esser trasferite a microscopio di elettroni (il modello deve esser costantemente raffreddato da azoto liquido) e poi può esser visto con un microscopio di elettroni praticamente nel loro stato nativo. Su come nativamente questo stato sono, certamente, discussioni. In teoria, se siamo stati celle così congelate, e poi l'abbiamo fatto scongelare molto bene senza la formazione di cristalli di ghiaccio, allora forse sarebbe perfino rianimato e continuato per vivere, sintetizzare sostanze diverse, e così via. Ma, purtroppo non lavora, comunque si spera che è uno stato nativo. E quando tali tagli guardarono e studiarono nuclei d'interfase, dove i chromatin compactisized in modo vario compactisized chromatin fortemente compactisized, e hanno chromatin diffuso, che è la sintesi di RNA attiva, e in esso il livello di compaction sotto - e anche considerò cromosomi mitotic dove chromatin intero compactisized, la cosa sorprendente fu quella che nessuno in quelli di qualsiasi altro campione chromatin elementare fibril non è trovato. Non è stato semplice. Nucleosomes sono chiaramente visibili, e chromatin elementare 30-nanometer fibrils no.
La situazione ha spento esattamente il contrario rispetto a quello che è stato nelle prime fasi di cromosoma studiante compaction. Allora il primo pensiero che là nucleosome fibril 10-nanometer, nient'altro. Allora si è scoperto che questo non è il caso, la gente ha discusso, ha discusso, ha scritto articoli. Sono venuti a conclusione che, molto probabilmente, soltanto nucleosome fibrils, ma c'è chromatin fondamentale fibrils. E qui si scopre che è necessario ritornare a quel chromatin fondamentale fibrils - un manufatto, non sono, e c'è fibril eccellente nucleosome.
È abbastanza frustrante per quella gente che ha creduto tutta la mia vita che ci sono due livelli di compaction, e si è scoperto che uno di loro non è. Per di più, si è scoperto che adesso è possibile per l'individuo controllare in vivo nucleosome. Si ha constatato che nucleosomes dentro il nucleo instabile, diffondono una piccola mossa. Allora c'è stata un'idea, perché non fanno vediamo questo chromatin elementare fibrils. chromatin elementare fibrils se sono stati situati vicino all'un l'altro. Nucleosomes si muovono, e come sarebbero capaci di penetrare nell'un l'altro. E l'assenza di fibrils elementare chromatin, sebbene indirettamente suggerisca che l'interazione di proteine histone succede non solo in nucleosomes, ma anche, per esempio, tra fibrils individuale. È, in linea di principio, un fatto ben noto, questo è il caso. E, per di più, molto attivamente sviluppa la direzione provando a simulare il computer chromatin compaction. Questo è un processo in modo imparziale complesso richiede l'uso di un supercomputer. Ancora incapace di contare nel computer, siccome debba la molecola di DNA compactisized.
Da un lato, sì, un rigetto del vecchio, l'altro - nuove opportunità. Questo è una struttura dinamica in cui le molecole individuali fibrils possono veramente penetrare l'un l'altro. È perciò, per il fatto che penetrano nell'un l'altro e si trovano a una distanza dall'un l'altro, non possiamo vederli. Se questa distanza è stata, li avremmo visti. Si trovano fianco a fianco, capaci di penetrare nucleosomes individuale fibrils dall'un l'altro, e fibrils individuali non sono formati, e una soluzione fusa comune nucleosome fibrils. Dove proprio è venuto da chromatin elementare fibrils, hanno visto durante molti decenni? Qui, tutto è stato molto semplice: se tiene una fissazione di aldeide normale, e poi lo impara in uno stato congelato, allora chromatin elementare 30-nanometer fibril è visibile. Questo è un manufatto di fissazione. Per il fatto che quando stretto con un morsetto fibril fissaggio di esso visibile. E se non è arricciato, allora avremmo visto un campo solo di molecole fuse compactisized l'utilizzazione di DNA histone le proteine.
Carro
