Determinazione della successione di DNA

Il Biophysicist il dr. Doping racconta su lettura di successioni di DNA da gel electrophoresis e sequencing del genoma umano. Poiché quali raggiungimenti di Frederick Sanger hanno vinto due Premio Nobel in Chimica? Come fa la lettura della successione di nucleotides nel DNA? Quale metodo permette di separare la molecola di DNA in lunghezza?

I due primi decenni dopo l'inizio di biologia molecolare, fu molto capito riguardo alla natura molecolare di vita, il dogma centrale famoso fu formulato, è stato completamente decifrato il codice genetico dopo la scoperta dell'elica doppia da Watson e Spasmo muscolare, che permette alla cella di trasferire la proteina di testi di testi di acidi nucleici, la successione di DNA nucleotides e RNA - in una successione di residui di amminoacido in proteine. È stato un gran raggiungimento nella comprensione della base molecolare di vita.

La Vitamina B12 d'iniezione di Cyanocobalamin - è estremamente essenziale per fabbricazione di sintesi di DNA.

Il problema, comunque, è stato quello che, sebbene i biologi molecolari abbiano parlati sempre di questi testi, nessuno ha saputo i testi stessi. Non c'è stato modo di leggere i testi di geni e è tra i geni. In altre parole, non c'è stato metodo per determinare la successione di nucleotides in DNA.

È capace di fare per la proteina - il metodo di lettura di successione di proteina fu sviluppato all'inizio degli anni 50, perfino prima della scoperta dell'elica doppia, un po' sappia come leggere successioni di RNA corte, e le successioni di DNA non potevano leggere affatto. Questo ha creato uno spazio vuoto enorme nella comprensione reale della base molecolare di vita e ha impedito lo sviluppo ulteriore di biotecnologia, che, a rigor di termini, non è stata là, e l'uso medico di questa conoscenza.

Alla metà 70-ies dello XX secolo, ci fu una scoperta decisiva. Prima di quel tempo, sembrò che fu troppo difficile, che non può esser risolto - tutti i tentativi risultarono che non ha successo. Il metodo di determinare la successione è stato sviluppato dal chimico britannico Frederick Sanger.

Sanger - un gran uomo, l'unico nella storia di scienza, chi ha ricevuto due Premio Nobel in Chimica. Nobel vietato di dare due volte lo stesso Premio di uomo nella stessa area. Ma Sanger aveva già ricevuto il premio per lo sviluppo di un metodo di leggere le successioni di amminoacido in proteine. E quando sviluppò un metodo di leggere la successione di DNA, il comitato di Nobel fu in una situazione molto difficile: non è stato un uomo per dare il premio per scoperta eccezionale o rompere il testamento di Nobel. Abbiamo deciso lo stesso in questo caso violano la volontà, ma lo fanno molto a malincuore. Questo è l'unico caso nel campo di chimica. Un caso simile è ancora nel campo di fisica e tutto.

Come adesso leggere la successione di DNA? Da allora, questa area ha un progresso enorme, e è basata su una scoperta decisiva che ha fatto Sanger. Se parliamo della lunghezza delle successioni di DNA, per esempio, vogliamo determinare la successione del genoma umano intero, che è adesso molto facile da fare - è una lunghezza di testo colossale. Ognuno di noi la cella ha un genoma che consiste di tre miliardi di nucleotides, tre miliardi di unità. Questo è un tal testo: Un T G C Un T G G G Un T T T C C - qualcosa come così, tre miliardi di lunghezze. Questo è il testo che deve esser letto. Non è una molecola di DNA - in effetti hanno 23 anni, perché abbiamo 23 cromosomi, ancora ogni molecola terribilmente a lungo e contiene centinaia di milioni di unità.

Come leggerlo? In primo luogo, il DNA è stato tagliato a pezzi con enzimi speciali che sono chiamati «l'enzima di restrizione». Gli enzimi di restrizione riconoscono successioni di DNA corte che contengono da parte di circa 6 a 8 nucleotides, e solo a questo posto un modo preciso taglia il DNA l'elica doppia. Questo è aperto tali «forbici», fu anche una scoperta decisiva all'inizio degli anni 70, quando furono scoperti, questi enzimi sono trovati in celle batteriche, che producono una tale talea di tali «forbici» molto specifiche. Ci sono molti diversi, quindi può tagliare il DNA in pezzi corti in un modo, una strada completamente diversa, una terza strada, una quarta strada. Questo è fatto abbastanza facilmente.

Più lontano c dal metodo che è chiamato «il gel electrophoresis», le molecole di DNA sono separate molto dolcemente in lunghezza.

E il compito adesso è quello garantire che determinano la successione di pezzi corti - può contenere cento o parecchie centinaia di unità. Usa il metodo di Sanger.

Un tal frammento di molecola ha aggiunto con adattatori speciali a entrambe le fini, perché le foglie di enzima di restrizione hanno dentellato fini che sporgono porzioni di filo e, usando questi frammenti di filo solo, l'adattatore può esser aggiunto. L'adattatore avrà una successione certa, che abbiamo scelto, è sintetico. Così, ogni pezzo adesso ha una successione molto precisa alle fini di cui sappiamo. E possiamo usare la successione conosciuta per aggiungere a questi frammenti, testi elementari, poiché sarà disponibile su catena complementare sintetizzata della successione di DNA.

L'idea di Sanger è stata quella che quando una tale fusione succede, è necessario aggiungere al miscuglio del precursore normale nucleotides, chiamato triphosphates tale che non può esser esteso. Questo è una modifica chimica speciale di uno zucchero nucleotide - tale che se nucleotide aggiunto è incorporato nella catena, il DNA polymerase non può estendersi al di là di esso. Il campione è diviso in quattro parti, e ogni parte, insieme con triphosphates normale sono aggiunti triphosphates chimicamente ha modificato basi.

Quando la catena complementare è sintetizzata con DNA polymerase, con una probabilità certa, si ferma quando è incassato nucleotide a caso modificato. Come risultato, nel nostro campione in cui abbiamo un numero enorme di molecole identiche, che è la sintesi, otteniamo una serie di molecole che hanno questa lettera, dicono T o A, che in questo caso abbiamo aggiunto al gruppo di quei predecessori, abbiamo aggiunto la sintesi di precursore modificata otteniamo un arresto a questo posto. Così abbiamo la lunghezza delle molecole che ci dicono esattamente dove in questa lettera è costruito. E poi là è solo spaccato lungo la molecola, che è fatta da gel electrophoresis. Le permette di separare queste molecole in lunghezza, e dov'è il nucleotide, che attualmente studiamo, vedremo una sintesi di arresto, cioè la lunghezza dei frammenti, quando li condividiamo in lunghezza, corrispondendo al numero di nucleotides, quando, dica, gli stand della lettera T in successione. Questo è fatto per la lettera T, per la lettera A, per la lettera G per la lettera C, e quindi leggiamo la successione intera.

Questo è un metodo meraviglioso, ingegnoso di consequenziali letti, Sanger ha coniato. Ha permesso in fin dei conti sequenced il genoma umano - è detto a successione il genoma. E adesso, poiché il primo genoma umano, che fu letto all'inizio di questo secolo, e che costa soldi enormi, su stessi tre miliardi di dollari solo, per il fatto che questi metodi furono robotized e pesantemente modificarono, è costi adesso molto più a buon mercato per determinare la successione. Il prezzo è vicino a $1,000 - per determinare la successione dell'uomo individuale. Già il sequenced i genomi di migliaia di persone, e sono analizzati. È lo sviluppo assolutamente incredibile di metodi di DNA sequencing ha creato il progresso enorme nella comprensione della natura molecolare di vita, e nell'applicazione di biotecnologia e medicina.